Велемудр

Исследователи большие надежды возлагают на систему CRISPR/Cas9, позволяющую вносить с большой точностью изменения в геном живых существ, в том числе и людей Периодически появляются новые научные работы, которые рассказывают о разного рода разновидностях данной технологии и их модификациях. Только в текущем годы таких модификаций было несколько.

Необходимо отметить, что CRISPR/Cas9 является системой адаптивного иммунитета микроорганизмов, в частности, бактерий, которая помогает им бороться с различными вирусами. Состоит она из определенных участков ДНК, которые называют спейсерами и которые соответствуют фрагментам ДНК инфекции. Спейсеры занимаются кодированием специфических молекул crРНК, связывающимися с белковым ферментом Cas9. Комплекс, который образуется в итоге, соединяется с цепочкой ДНК вируса, а белок работает как ножницы, перерезая эту цепочку.

Ученые говорят о том, что система CRISPR/Cas9 является лишь одной из многих систем подобного рода, которые используются бактериями и археями. Их можно разделить на несколько классов. В первый ученые относят системы I, III, IV типов, во второй – системы II, V типов. Система II типа содержит белковый фермент Cas9, который принимает участие в накоплении в клетке crРНК, получении новых спейсеров и разрезании ДНК. Другие системы для этих целей используют мультибелковые комплексы. Благодаря этому II тип читается наиболее простым видом систем подобного рода, который подходит для нужд генной инженерии.

В свою очередь, типы могут делиться на подтипы – все зависит от тех дополнительных генов, которые связаны с CRISPR. В частности, тип IIA содержит ген csn2, кодирующий белок, который связывается с ДНК и принимает участие в приобретении новых спейсеров. Системы IIB данного гена лишены, но в них присутствует ген cas4, функцию которого ученые пока не определили, а в системе типа IIC нет ни одного, ни другого гена.

Все CRISPR-системы, известные ученым, были обнаружены в составе бактерий, выращенных в условиях лаборатории. Вместе с тем, существует великое множество некультивируемых археев и бактерий, которые в большинстве своем обитают в экстремальных условиях – в заброшенных шахтах в токсических водоемах и минеральных источниках. Впрочем, ученые могут выделить ДНК из них и выявить соответствующие участки. В одной из своих новых работ, которая была опубликована в конце декабря, исследователи Калифорнийского университета говорят о том, что им удалось расшифровать геномы из природных микроорганизмов, обнаружив при этом новые виды CRISPR-систем.

Ученые установили, что у некоторых малоизученных видов археоподобных организмов ARMAN также имеется система CRISPR/Cas9, между тем как ранее исследователи полагали, что она присуща исключительно бактериям. Генетики отмечают, что данная система находится между подвидами IIC и IIB и служит защитой от так называемых «прыгающих» паразитических генов или транспозонов, которые попадают из архей в микроорганизмы. Ученые попытались воспроизвести в кишечной палочке активность обнаруженной CRISPR-системы, но все их попытки не увенчались успехом. Это, по словам исследователей, может свидетельствовать о существовании неизвестных специфических дополнительных механизмов, которые регулируют систему.

Помимо этого, ученые выделили также новые виды систем из бактерий, которые обитают в подземных отложениях и водах. В частности, речь идет о системах внутри второго класса — CRISPR/CasX и CRISPR/CasY. Первая система содержит белки CasX, Cas1, Cas2 и Cas4. Первый из этих белков, как показали исследования, имеет нуклеазную активность, иными словами – он, подобно белковому ферменту Cas9, может расщеплять чужеродную ДНК. Но в то же время, это происходит лишь в том случае, когда перед вирусными фрагментами имеется последовательность TTCN, в которой N является любым из четырех нуклеотидов. Подобные последовательности называют РАМ. Система CRISPR/Cas9 также обладает своей РАМ – NGG, и она должна располагаться перед вирусными спейсерами. Помимо этого, система CRISPR/CasY может разрезать ДНК в том случае, когда рядом со спейсером имеется последовательность РАМ — ТА.

Ученые уверены в перспективности своего открытия виду того, что все эти обнаруженные системы являются наиболее компактными из известных им в данное время. По словам исследователей, для работы систем CRISPR/CasX и CRISPR/CasY необходимо небольшое количество белков, что делает их самыми удобными инструментами в процессе редактирования ДНК. Помимо того, в ходе метагеномных исследований, в которых изучается ДНК из окружающей среды, можно попытаться обнаружить новые разновидности CRISPR-систем, которые будут полезны для генной инженерии.

Генетики отмечают, что в природе существует альтернатива поиску CRISPR-систем. Это усовершенствование той технологии, которая уже существует. Она достаточно точна, но в то же время допускает некоторые ошибки, к примеру, разрезает ДНК не в том месте, что не дает возможности вносить в гены правильные изменения и лечить эффективно наследственные заболевания. Именно поэтому ученые заняты поисками способов улучшения работы системы. На протяжении 2016 года было появилось немало научных исследований, которые были призваны модифицировать технологию CRISPR и превратить ее в разные генные инструменты.

К примеру, в начале декабря ученые из университета Торонто, которые создали систему анти-CRISPR, которая при наличии определенных условий выключает механизм. Таким образом, в том случае, если направляющая РНК соединится не с тем ферментом, активность белка Cas9 подавляется и ошибки можно избежать. В состав анти- CRISPR входит три белка, которые ингибируют нуклеазу. Вполне очевидно, изначально система была изобретена вовсе не учеными, а вирусами, обезвреживающими таким образом иммунитет бактерий.

В начале лета совместными усилиями американских и российских исследователей было подтверждено, что система CRISPR/C2c2, которую получили из фузобактерии Leptotrichia shahii, может резать одноцепочную РНК. Таким образом, система CRISPR может быть использована для подавления активности матричной РНК, переносящей информацию между генами и рибосомами, в которых на основании этой информации происходит синтез белка.

В мае специалистами Калифорнийского университета была создана технология CRISPR-EZ, благодаря которой у ученых появилась возможность вставлять новые молекулы ДНК в геномы мышиных эмбрионов с почти стопроцентной точностью. Система CRISPR/Cas9 вносится при помощи небольшого электрического разряда и микроскопической иглы в оплодотворенные яйцеклетки животных. В своих исследованиях ученые сумели внести мутацию в гены у 88 процентов грызунов, а это число превышает то количество генномодифицированных животных, которое удалось получить при помощи технологии генного редактирования с использованием обычных инъекций.

В апреле молекулярными биологами из Массачусетского универитета после применения мутантного варианта Cas9 без нуклеазной активности, была разработана технология CRISPRainbow. Направляющая РНК, которая указывала месте прикрепления ферментам, содержала флуоресцентные метки, за счет чего ученые получили возможность отследить перемещение генетических мобильных элементов.

В настоящее время ученые уже задумываются над тем, чтобы применять CRISPR-технологии при создании генномодифицированных организмов, в частности, малярийных комаров, которые будут распространять вредные гены среди своих диких сородичей. Данный метод носит название генного драйва: в том случае, если один из родителей имел мутантный ген, то с 50-процентной вероятностью он передаст его своему потомству. Это происходит по той причине, что родитель обладает двумя копиями генов, одна из которых дефектная. Система CRISPR может этот мутантный ген копировать и вставлять в здоровый ген. В конечном итоге, потомки получат 100-процентную мутацию.

В 2016 году экспертами Консультативного комитета по рекомбинантной ДНК была одобрена заявка Пенсильванского университета о проведении исследований по генетической модификации человека при помощи системы CRISPR/Cas9.

Но гораздо быстрее оказались китайские ученые. В ноябре в одном из специализированных изданий появилось сообщение о том, что они ввели впервые в истории в человеческий организм модифицированные с помощью технологии CRISPR/Cas9 гены. Ученые из крови больного метастазирующим раком пациента извлекли Т-лимфоциты или иммунные клетки, после чего применили технологию CRISPR/Cas9, отключив ген, кодирующий белок PD-1. Этот белок подавляет иммунитет, тем самым способствуя росту раковой опухоли. Исследователи увеличили количество отредактированных клеток, после чего ввели их обратно в организм человека. Но в настоящее время пока неизвестно, сумеет ли генная терапия справиться с болезнью.

Кроме этого, технологии CRISPR могут использоваться для борьбы с наследственными заболеваниями человека и ВИЧ. В то же время, чтобы разработать эффективные методы лечения, необходимо проведение дальнейших исследований. Несомненно, ни о каких мутантах, как в фантастических фильмах, речь не идет, но у ученых появится возможность быстро создавать генномодифицированные организмы, к примеру, сельскохозяйственные растения, устойчивые к паразитам. А обычным людям остается лишь гадать, почему ученые, которые открыли систему CRISPR и придумали, как и где ее можно использовать, все еще не получили Нобелевскую премию.

Источник